
产品货号:
BTN7-240113
中文名称:
木瓜样蛋白酶活性测定试剂盒
英文名称:
Papain-Like Protease Activity Assay Kit
产品规格:
100T
发货周期:
1~3天
产品价格:
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本制品是荧光法测定木瓜样蛋白酶(Papain-like protease,PLpro,EC 3.4.19.12)活性的试剂盒。试剂盒采用含LXGG序列的荧光标记多肽为底物,它被酶切后可在360nm激发产生460nm荧光,通过测定荧光值即可测定PLpro活性。

该酶选择性地识别并切割病毒多蛋白链的LXGG位点并参与复制酶的生成,它也催化蛋白脱泛素过程,在SARS-CoV-1和-2等冠状病毒成熟和致病机制中起着重要作用,因此快速检测其酶活具有重要的意义。为此本公司开发了基于荧光光度法的PLpro活性检测试剂盒。

- 即开即用,用户不需要单独购买并优化每个成分。
- 使用便捷,整个实验可以在2小时内完成。
- 96孔板模式,尤其适合高通量检测。不适合比色皿检测。
- 可用于含重组或天然PLPro酶的样本。
- 提供重组的SARS-CoV-2 PLpro和荧光标准品。
- 本制品足够100次96孔板测定实验,每次40μL反应体系。
- 一个木瓜样蛋白酶活性单位的定义为37℃温度下每分钟释放1pmol荧光物质的酶量。
- 本制品只可用于科研。

组分 | 规格 | 保存 |
PLpro荧光底物液 | 2mL | -80℃ |
5ng/μL重组SARS-CoV-2 PLpro酶液 | 50μL | |
2×PLpro反应液 | 25mL | -20℃ |
5μM荧光标准品溶液 | 100μL | |
DTT | 77mg |
保存:按标签指示条件保存,有效期6个月。

待测样品,超纯水,DMSO,96孔板(跟所用的荧光光度计兼容),可测340nm激发光/460nm发射光的荧光光度计。

一、准备工作
- 首次使用本试剂盒时,在DTT管中加入1mL自备超纯水,颠倒20次混匀后加20μL到PLpro荧光底物液中,加500μL到2×PLpro反应液中,轻柔颠倒20次混匀后待用。没用完时上述溶液均存-20℃。
二、配制至少6个稀释度的荧光标准品
- 配制1mL 1×PLpro反应液:在1个1.5mL离心管中加入0.5mL 2×PLpro反应液和0.5mL自备超纯水,涡旋1分钟混匀,常温放置待用。
- 标记7个1.5mL离心管,分别为0、1、2、3、4、5、6。
- 在每管中加入50μL 1×PLpro反应液。盖上0号管作为对照。
- 在6号管中加入50μL 5μM的荧光标准品溶液(试剂盒提供),涡旋1分钟混匀,得2.5μM的荧光标准品稀释液。常温放置待用。
- 换枪头,在5号管中加入50μL 2.5μM荧光标准品稀释液(上步稀释所得),涡旋1分钟混匀,得1.25μM荧光标准品稀释液。常温放置待用。
- 换枪头,在4号管中加入50μL 1.25μM荧光标准品稀释液(上步稀释所得),涡旋1分钟混匀,得0.625μM荧光标准品稀释液。常温放置待用。
- 重复上面的操作,直到在1~6号管中得到2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078μM共6个荧光标准品稀释液,加上0号管共7个样本。常温放置待用。此溶液每次需新鲜配制。
三、待测PLpro样本的制备
- 细胞培养上清液样本:收集培养细胞的上清,4℃ 1000×g离心10分钟,收集上清,取少量按1∶1的比例跟2×PLpro反应液混合,放冰上待用。未用完的存-80℃。
- 细胞裂解液样本:4℃ 500×g离心10分钟收集细胞,加入适量自备的细胞裂解液(建议使用CHAP细胞裂解液)到细胞沉淀中,重悬细胞,冰上放置10分钟裂解细胞,用枪头吹打5次,将裂解液全部转移到1.5mL离心管中,4℃ 10000×g离心5分钟,取少量按1∶1的比例跟2×PLpro反应液混合,测定蛋白浓度,待用。未用完的存-80℃。
四、PLpro酶切反应设置
- 如有N个待测样本,每个做1次重复,则反应数为N+8,其中N个用于待测样本,1个用于空白对照,1个用于PLpro阳性对照,6个用于标曲样本。如每个样本做重复,则反应数应相应地变动。以下按1个样做1次重复示例。
- 在96孔板的各反应孔中按下表顺序加入各成分,反应总体积为40μL。
成分 空白
对照孔阳性
对照孔N+2个
待测样品孔标曲样品孔
(0~6管)1×PLpro反应液 20μL - - - 5ng/μL PLpro酶液 - 20μL - - N+2个待测样本 - - 各20μL - 7个标准品稀释液 - - - 各40μL PLpro荧光底物 20μL 20μL 20μL - - 摇晃30秒混合均匀,放37℃保温,每5分钟在340nm激发光/460nm发射光条件下记录一次荧光值,共30分钟。
五、数据分析
- 从所有数据中减去空白对照值,然后进行下面的计算。
- 制作标准曲线求转换系数:6~0号标准品的浓度分别为2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0μM,反应体积为40μL,故换算成绝对量分别为100、50、25、12.5、6.25、3.13、0pmol,以其为横轴,以测出的荧光值为纵轴,得到标曲方程式。R2应大于0.95(如果不是线性,需要跟厂家联系),其斜率即为转换系数。
- 计算每个样本的斜率:以时间为横轴,以每个样本的荧光值为纵轴,得每个样本的线性区域(一般在前5~15分钟),然后计算出线性区斜率(速度)。
- 计算每个样本酶活性单位数:本试剂盒一个木瓜样蛋白酶活性单位的定义为在37℃温度下每分钟释放1pmol荧光物质的酶量,故40μL体系中PLpro酶活性单位数=线性区斜率÷转换系数。
- 由于40μL反应孔中加入的样本体积是20μL,上步得到的酶单位数相当于20μL待测样本的酶单位数,根据第9步或第10步计算出的蛋白浓度,可计算出20μL样本中蛋白的μg数,则酶的比活=20μL样本中的酶单位数/20μL样本中的蛋白μg数。
- 本试剂盒提供的重组SARS-CoV-2PLpro酶液酶活性为71.85U/mL,故比活为14.37U/μg,如果所测结果跟此数字不同,请跟厂家联系,找到原因后再继续。
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